骨髓單個(gè)核細(xì)胞分離方法及注意事項(xiàng)

骨髓單個(gè)核細(xì)胞（Bone Marrow Mononuclear Cells，BMMNCs）是一群混合細(xì)胞，其中絕大多數(shù)是早幼粒細(xì)胞、早幼紅細(xì)胞、成熟B細(xì)胞、T細(xì)胞和單核細(xì)胞等，還含有少量的干細(xì)胞，包括間充質(zhì)干細(xì)胞、造血干細(xì)胞和內(nèi)皮祖細(xì)胞等，它們密度相近，因此可通過密度梯度離心法從骨髓液中分離出來。

單個(gè)核細(xì)胞的體積、形態(tài)和比重與其它細(xì)胞不同，在沉降過程中不同比重的細(xì)胞會(huì)處于不同的分布位置。因此，可利用各種血細(xì)胞和單個(gè)核細(xì)胞比重之間的差異將各種血細(xì)胞與單個(gè)核細(xì)胞分離開來。

1）  無菌條件下抽取骨髓于含抗凝劑的采血管內(nèi)，將骨髓與生理鹽水或PBS溶液按等比例混勻，備用。

2）  按照稀釋骨髓：細(xì)胞分離液比例為3:2的比例，緩慢將稀釋骨髓液加入到細(xì)胞分離液上層，需保持液面分界清晰。

3）  800g，室溫，離心 20min-30min（注：設(shè)置較慢的加速度和減速度，如果有十檔，設(shè)為第三檔）。

4）  小心吸取骨髓單個(gè)核細(xì)胞層（即白膜層）并轉(zhuǎn)移至15mL離心管中。離心結(jié)束后，管內(nèi)液面從上至下依次為無細(xì)胞骨髓液層、骨髓單個(gè)核細(xì)胞層、分離液層和紅細(xì)胞層（見圖1）。

5）  向離心管中加入10mL 的生理鹽水或PBS重懸細(xì)胞，250g，室溫離心 10min ，棄上清。重復(fù)該步驟 1~2 次，即可用于后續(xù)試驗(yàn)。

1）  不同種屬動(dòng)物單個(gè)核細(xì)胞的比重有一定差異，請(qǐng)選擇合適的分離液進(jìn)行骨髓單個(gè)核細(xì)胞的分離。

2）  骨髓液新鮮程度是影響分離效果的關(guān)鍵因素，請(qǐng)盡量使用采集后24小時(shí)內(nèi)的骨髓液進(jìn)行單個(gè)核細(xì)胞分離。

3）  為保證細(xì)胞的活力，整個(gè)操作過程請(qǐng)輕柔，避免對(duì)細(xì)胞造成機(jī)械性的損傷。

4）  為保持細(xì)胞狀態(tài)良好，請(qǐng)盡量縮短整個(gè)試驗(yàn)的周期。

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